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细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit)操作方法
2019.06.27   点击174次

一、制作标准曲线(测定细胞具体数量?#20445;?/strong>

1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液?#26800;?#32454;胞数量,然后接种细胞。

2、按比例(例如:1/2比例)?#26469;?#29992;培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度,一般要做3-5个细胞浓度梯度,每组3-6个复孔。

3、接种后培养2-4小时使细胞贴壁,然后加CCK试剂培养?#27426;?#26102;间后测定OD值,制作出一条以细胞数量为横坐标(X轴),  OD值为纵坐标(Y轴)的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量(试用此标准曲线的前提是实验的条件要  一致,便于确定细胞的接种数量以及加入CCK后的培养时间。)

二、细胞活性检测

1、在96?#35013;?#20013;接种细胞悬液(100μL/孔)。将培养板放在培养箱?#24615;?#22521;养(在37℃,5% CO2的条件下)。

2、向每?#20934;?#20837;10 μL的CCK溶液(注意不要在?#23383;?#29983;成气泡,它们会影响OD值的读数)。

3、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

4、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

5、如果暂时不测定OD值,打算以后测定的话,可以向每?#23383;?#21152;入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。

三、细胞增值-毒性检测

1、在96?#35013;逯信?#32622;100μL的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24小?#20445;?#22312;37℃,5% CO2的条件下)。

2、向培养板加入10μL不同浓度的待测物质。

3、将培养板在培养箱孵育?#27426;問实?#30340;时间(例如:6、12、24或48小?#20445;?/p>

4、向每?#20934;?#20837;10μL CCK溶液(注意不要再?#23383;?#29983;成气泡,它们会影响OD值的读数)。

5、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

6、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

7、如果暂时不测定OD值,打算以后测定的话,可以向每?#23383;?#21152;入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。

注意:如果待测物质有氧化性或还原性的话,可在加CCK之?#26696;?#25442;新鲜培养基(除去培养基,并用培养基洗涤细胞两次,然后加入新的培养基),去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下,可以不更换培养基,直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

备注:

① 建议先做几个孔摸索接种细胞的数量?#22270;?#20837;CCK试剂后的培养时间。

② 有条件的情况下建议采用多通道移液器,可以减少平行?#20934;?#30340;差异。加入CCK试剂?#20445;?#24314;议斜贴着培养板壁加,不要插到培养基页面?#24405;櫻?#23481;易产生气泡,会干扰OD值读数。

③ 白细胞可能需要培养较长时间。

④ 当使用标准96?#35013;迨保?#36148;壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔 (100 μL 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对?#31995;停?#22240;?#36865;?#33616;接种量不低于2,500 个/孔 (100 μL 培养基)。如果要使用24?#35013;?#25110;6?#35013;?#23454;验,请先计算每孔相应的接种量,并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK溶液。

 ⑤ 如果没有450nm的滤光片,可以使用吸光度在430-490 nm之间的滤光片,但是450nm滤光片的检测灵敏度最高。                              

 ⑥ 培养基中酚红的吸光度可以在计算?#20445;?#36890;过扣除空白?#23383;斜?#24213;的吸光度而消去,因此不会对检测造成影响。

活力计算:

细胞活力*(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)] ×100

A(加药):具有细胞、CCK溶液和药物溶液的孔的吸光度

A(空白):具?#20449;?#20859;基和CCK溶液而没有细胞的孔的吸光度

A(0加药):具有细胞、CCK溶液而没有药物溶液的孔的吸光度

* 细胞活力:细胞增殖活力或细胞毒性活力

1.一个?#23383;?#24212;接种多少个细胞当使用标准96?#35013;迨保?#36148;壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔 (100 μl 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对?#31995;停?#22240;?#36865;?#33616;接种量不低于2,500 个/孔 (100 μl 培养基)。如果要使用24?#35013;?#25110;6?#35013;?#23454;验,请先计算每孔相应的接种量,并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。

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